WB蛋白质印迹电泳流程顺序及关键步骤详解
样品制备
收集样本：细胞或组织样本处理后裂解（使用含蛋白酶抑制剂的裂解液）。
离心：去除碎片，取上清液测定蛋白浓度（如BCA法）。
变性：加入上样缓冲液（含SDS、β-巯基乙醇），煮沸5-10分钟使蛋白质变性。
SDS-PAGE电泳
制胶：配制分离胶（根据目标蛋白分子量选择浓度）和浓缩胶，灌胶后插入梳子。
上样：将样品与预染Marker加入加样孔。
电泳条件：初始低电压（80V）使样品通过浓缩胶，后调高电压（120V）进行分离胶电泳，直至溴酚蓝抵达胶底部。
转膜（湿转/半干转）
平衡凝胶与膜：将凝胶和PVDF/硝酸纤维素膜浸入转膜缓冲液。
转膜装置：按“三明治”结构（负极→海绵→滤纸→凝胶→膜→滤纸→海绵→正极）组装，确保蛋白质从凝胶向膜转移。
转膜条件：恒流200-300mA，1-2小时（湿转）或更高电压短时间（半干转）。
验证：用预染Marker或丽春红短暂染色确认转膜成功（染色后需彻底洗净）。
封闭
封闭液选择：5%脱脂奶粉或BSA（磷酸化蛋白建议用BSA）溶于TBST。
封闭条件：室温摇动封闭1小时，减少非特异性结合。
一抗孵育
稀释一抗：用封闭液稀释至合适浓度（参考抗体说明书）。
孵育条件：4℃过夜或室温1-2小时，轻柔摇动。
洗涤：TBST洗膜3次，每次5分钟，去除未结合抗体。
二抗孵育
稀释二抗：用封闭液稀释HRP或荧光标记的二抗。
孵育条件：室温1小时，避光（荧光标记）。
洗涤：TBST洗膜3次，每次5分钟。
检测
化学发光法（HRP标记）：
ECL试剂A/B等体积混合，滴加至膜上，反应1-2分钟。
暗室中X光片曝光或成像系统捕获信号，优化曝光时间。
荧光法：使用荧光成像系统直接扫描膜上信号。
关键注意事项
转膜方向：确保膜与凝胶正确接触，避免反向导致转膜失败。
背景控制：封闭充分，洗涤彻底，抗体浓度优化。
蛋白变性：避免过度煮沸导致聚集，可调整还原剂用量。
胶浓度选择：低浓度胶（8%）适合大分子量，高浓度（12-15%）适合小分子量。